Ny kraftfull metod tar studier av genetiska bibliotek till nästa nivå


Vi har utvecklat en ny metod för att undersöka dynamiska processer i stora genetiska bibliotek. Genom att applicera metoden på cellcykelreglering bidrar vi till en tydligare bild av den gäckande kontrollmekanismen.

Med hjälp av modern genteknologi kan vi introducera tusentals olika DNA-förändringar i mänskliga celler eller bakterier för att på så vis skapa genetiska bibliotek. CRISPR/cas9-systemet, eller ”gensaxen” som den också kallas, kan modifieras och användas för att justera uttrycket av tusentals olika proteiner. Genom att förse varje modifikation med en genetisk streckkod, kan vi hålla reda på vilken cell som bär på vilken förändring.

Samtidigt har utvecklingen inom optik och bildanalys gjort det möjligt att undersöka de kemiska processerna inuti cellen med oerhört hög precision. I princip är det möjligt att ”filma” grundläggande biologiska förlopp som proteinuttryck eller celldelning inuti en levande cell.

Tänk dig nu att det vore möjligt att kombinera de avancerade optiska metoderna med storskalig genteknik. Om vi är intresserade av en viss biologisk process skulle vi i teorin kunna identifiera samtliga inblandade gener genom att observera den biologiska processen i ett genetiskt bibliotek. Studier som hittills tagit flera år i anspråk skulle kunna genomföras i ett enda experiment – i teorin.

De utmaningar som hittills hindrat oss från att omsätta teorin i praktiken har i stort sett varit tekniska. Hur gör man för att hålla reda på tusentals olika celler så att man först kan undersöka deras biologi och sedan läsa av den genetiska streckkoden? Vi antog utmaningen o­­­ch resultatet stavas ”DuMPLING”, ett microchip som rymmer ett helt cellbibliotek med tiotusentals olika celler. Materialet i chippet har väldigt bra optiska egenskaper, vilket betyder att vi kan utföra i princip alla studier på chippet, även de som kräver avancerad mikroskopi.

Eftersom vi är intresserade av vad som styr cellcykeln i bakterier, var detta ett naturligt problem att testa den nya tekniken på. I alla celler, även mänskliga, är det livsviktigt att allt DNA kopieras exakt en gång innan varje celldelning, annars riskerar cellen att förlora genetiskt material, alternativt att ackumulera DNA med lika förödande konsekvenser. Trots att cellcykelreglering har studerats i decennier är det fortfarande oklart hur cellerna åstadkommer den strikta kontroll som krävs. Vi kan ta fram modeller som fungerar, men eftersom vi inte ens känner till alla spelarna, är det väldigt svårt att avgöra om modellerna är biologiskt relevanta. Med hjälp av den nya metoden hoppas vi kunna fiska fram de okända komponenterna.

Vi skapade ett genetiskt bibliotek där vi vridit ner uttrycket av olika kända cellcykelreglerare samt ett antal orelaterade gener och använde sedan DuMPLING för att studera hur cellcykeln påverkades av dessa modifikationer. Och nu kommer det finurliga. När all cellcykeldata är insamlad, byter vi ut näringslösningen mot en vätska som fixerar cellerna och bevarar dem i sina positioner. Vi kan nu läsa av den genetiska streckkoden på chippet med hjälp av färgkodade DNA-snuttar och automatisk bildanalys.

Resultatet är uppmuntrande. Från den data som samlats in kan vi identifiera de flesta av de kända regulatoriska elementen, vilket betyder att metoden fungerar, men eftersom DuMPLING producerar tidsupplöst data kan vi också säga på vilket sätt cellcykeln påverkats av de olika modifikationerna. Nästa steg är att utöka biblioteket till att omfatta samtliga gener i bakteriegenomet; förhoppningsvis kommer detta att innebära ännu ett steg närmare en fullständig beskrivning av bakteriecellcykelns kontrollmekanism.

Studien är publicerad i tidskriften Nature Methods: https://www.nature.com/articles/s41592-019-0629-y

Mer information om forskningen i Elflabbet: http://elflab.icm.uu.se/

 


Läs mer